摘要

研究了兩種抗菌肽magainin 2和indolicidin與三種不同模型生物膜的相互作用，即單層膜、大單層囊泡（luv）和巨大脂質(zhì)體。當(dāng)1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿（SOPC）膜中的酸性磷脂1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油（POPG）的含量增加時(shí)，兩種肽插入脂質(zhì)單層的能力逐漸增強(qiáng)。吲哚青霉素和馬蓋寧2也滲透到含有膽固醇的脂質(zhì)單層中（摩爾分?jǐn)?shù)，X=0.1）。通過(guò)含芘脂肪酸的磷脂衍生物1-棕櫚酰-2-[10-（芘-1-基）癸酰基]-sn-甘油-3-磷酸-rac-甘油（PPDPG）的準(zhǔn)分子/單體熒光比Ie/Im的降低，揭示了magainin 2的膜結(jié)合減弱了含POPG的LUV中的脂質(zhì)側(cè)向擴(kuò)散。同樣，觀察到含有二苯基己三烯（DPH）的膜的穩(wěn)態(tài)熒光各向異性增加，揭示了magainin 2增加酰基鏈順序并誘導(dǎo)酸性磷脂分離。吲哚西丁也有類似的作用。用光學(xué)顯微鏡觀察了magainin2和吲哚青霉素對(duì)磷脂膜的拓?fù)湫?yīng)。Magainin 2對(duì)SOPC或SOPC:膽固醇（X=0.1）巨型脂質(zhì)體基本沒(méi)有影響。然而，當(dāng)酸性磷脂（XPG=0.1）包含在巨大囊泡中時(shí)，觀察到有效的囊泡形成。吲哚西丁只引起巨大SOPC囊泡的輕微收縮，而當(dāng)巨大脂質(zhì)體含有POPG（XPG=0.1）時(shí)，觀察到內(nèi)吞囊泡的形成。有趣的是，對(duì)于吲哚肽，由SOPC/膽固醇（Xchol=0.1）組成的巨大囊泡也可觀察到囊泡形成。討論了這兩種多肽誘導(dǎo)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)化的可能機(jī)制。

介紹

在過(guò)去十年中，在動(dòng)植物和細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多的抗菌肽，如天蠶素、防御素、馬蓋寧、蜂毒素、吲哚青霉素和阿拉米霉素。這些肽在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中用于進(jìn)攻和防御目的（Sansom，1991；Saberwal和Nagaraj，1994；Matsuzaki，1998），通過(guò)與脂質(zhì)相互作用，以某種方式干擾靶細(xì)胞膜的屏障特性（Bechinger，1997；Matsuzaki，1998，1999；Oren和Shai，1998；Shai，1999；Sitaram和Nagaraj，1999）。作為陽(yáng)離子，抗菌肽優(yōu)先與細(xì)菌中特別豐富的酸性脂質(zhì)相互作用（Op den Kamp，1979），從而為細(xì)胞特異性的差異提供了基礎(chǔ)（Matsuzaki等人，1995a）。上述特性使這些肽成為研究脂質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的一個(gè)有趣領(lǐng)域，并可能進(jìn)一步開發(fā)新的抗菌、抗癌和抗病毒化合物。

我們?cè)谶@里報(bào)告了兩種抗菌肽，馬蓋寧2和吲哚青霉素與脂膜相互作用的比較。Magainin和indolicidin根據(jù)其氨基酸組成和二級(jí)結(jié)構(gòu)屬于不同的抗菌肽家族（Falla等人，1996年）。因此，magainin是類脂膜中呈現(xiàn)兩親性=-螺旋結(jié)構(gòu)的一個(gè)范例（Matsuzaki，1999），而吲哚肽屬于另一個(gè)類脂雙層中具有獨(dú)特氨基酸組成和非α-螺旋構(gòu)象的類脂（Ladokhin et al.，1999；Ha et al.，2000）。在非洲爪蟾爪蟾的皮膚中發(fā)現(xiàn)了Magainins，并在非溶血濃度下顯示出廣譜抗菌（Zasloff，1987；Zasloff等人，1988）和抗癌細(xì)胞活性（Crucani等人，1991；Baker等人，1993）。為此，有興趣的青蛙皮膚提取物已被用于中醫(yī)藥中的皮膚感染的控制（L.Miao，羅斯基勒大學(xué)，個(gè)人通信，2000）。Magainin 2由23個(gè)氨基酸殘基（GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS）組成，具有4的正凈電荷，并通過(guò)滲透細(xì)菌膜發(fā)揮其抗菌活性（Matsuzaki等人，1997年）。已經(jīng)提出形成肽-脂質(zhì)超分子復(fù)合物孔，允許離子、脂質(zhì)和肽的跨雙層運(yùn)輸，同時(shí)跨膜電位和脂質(zhì)不對(duì)稱性的耗散（Matsuzaki et al.，1995a，b，c，1996，1998；Ludtke et al.，1996）。magainin對(duì)亞微觀脂質(zhì)囊泡作用的光譜和動(dòng)力學(xué)研究（Matsuzaki等人，1995a，b，c，1996，1998；Ludtke等人，1996）揭示了相互作用的協(xié)同性質(zhì)。然而，magainin對(duì)膜擾動(dòng)的確切機(jī)制仍存在爭(zhēng)議。

吲哚青霉素存在于牛中性粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)顆粒中（Selsted等人，1992年），具有獨(dú)特的氨基酸組成，其13個(gè)氨基酸序列中有5個(gè)Trp和3個(gè)Pro殘基（ILPWR）。它是最短的天然線性抗菌肽之一，與magainin類似，對(duì)革蘭氏陰性和陽(yáng)性細(xì)菌（Selsted et al.，1992）和真菌（Ahmad et al.，1995）以及原生動(dòng)物（Aley et al.，1994）具有活性。吲哚西丁對(duì)大鼠和人T淋巴細(xì)胞也有細(xì)胞毒性（Schluesener等人，1993年），分解紅細(xì)胞（Ahmad等人，1995年），并具有抗HIV-1的活性（Robinson等人，1998年）。吲哚肽優(yōu)先與酸性磷脂結(jié)合，盡管它也與中性磷脂結(jié)合（Ladokhin等人，1997）。已證明吲哚青霉素可滲透大腸桿菌外膜（Falla等人，1996年；Subbalakshmi等人，1996年），形成通道，如平面雙層電導(dǎo)測(cè)量所示（Falla等人，1996年；Wu等人，1999年）。吲哚西丁對(duì)細(xì)胞膜的高親和力、不尋常的氨基酸組成和小體積使其成為一種有趣的抗菌劑。其抗菌活性、電荷要求以及Trp和Pro殘基對(duì)生物活性的重要性已被廣泛研究（Sitaram和Nagaraj，1999）。然而，肽介導(dǎo)的細(xì)胞裂解的分子機(jī)制，即肽是否形成孔隙、像洗滌劑一樣溶解膜或誘導(dǎo)膜缺陷，仍然存在爭(zhēng)議（Sitaram和Nagaraj，1999）。

小的和大的單層囊泡（LUV）繼續(xù)被廣泛用作模型膜。然而，這些脂質(zhì)體是亞微觀的，不允許分辨與生物膜更宏觀變化相關(guān)的形態(tài)學(xué)特征。所謂的巨大囊泡（10–500 m）是一種球形、封閉的分子雙層結(jié)構(gòu)，它能包裹一個(gè)水室，是研究波動(dòng)、萌芽、損傷和愈合的良好模型，以及膜作用試劑誘導(dǎo)的細(xì)胞樣行為的其他表現(xiàn)（Riquelme等人，1990年；Menger，1998年；Menger和Lee，1995年；Menger和Keiper，1998年；Angelova和Tsoneva，1999年；Angelova等人，1999年；Holopainen等人，2000年）。由于巨大的囊泡體積大，可以通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察到，從而可以直接可視化涉及超分子化學(xué)和生物物理學(xué)的過(guò)程（Luisi和Walde，2000）。在這項(xiàng)研究中，我們分別使用不同的膜模型，即單層膜、大的單層囊泡和巨大的脂質(zhì)體，來(lái)研究馬加寧和吲哚西定在膜中的滲透，它們對(duì)雙層脂質(zhì)動(dòng)力學(xué)的影響，以及膜的宏觀形態(tài)變化。

材料和方法

材料

Hepes、EDTA和magainin 2來(lái)自西格瑪（密蘇里州圣路易斯），吲哚西丁來(lái)自巴切姆（瑞士布本多夫）。經(jīng)各自供應(yīng)商提供的高效液相色譜分析驗(yàn)證，肽的純度分別>99%和>95%。通過(guò)質(zhì)譜證實(shí)了馬蓋寧2和吲哚青霉素的正確分子量和純度。1-硬脂酰-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿（SOPC）、1-棕櫚酰-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油（POPG）和>-膽固醇來(lái)自Avanti極性脂質(zhì)（Alabaster，AL）。對(duì)于熒光磷脂類似物，1-棕櫚酰-2-[10-（芘-1-基）癸酰]-sn-甘油-3-磷酸-rac-甘油（PPDPG）和1-棕櫚酰-2-[10-（芘-1-基）癸酰]-sn-甘油-3-磷酸膽堿（PPDPC）來(lái)自K&V Bioware（芬蘭埃斯波）。二苯基己三烯（DPH）來(lái)自EGA Chemie（Steinheim，德國(guó)）。使用高精度電子天平（Cahn，Cerritos，CA）通過(guò)重量法測(cè)定未標(biāo)記脂質(zhì)的濃度，并使用摩爾消光系數(shù)分別為38000 cm-1和88000 cm-1，通過(guò)341 nm處的吸光度法測(cè)定含芘磷脂和DPH的濃度。脂質(zhì)的純度通過(guò)薄層色譜法在使用氯仿/甲醇/水（65:25:4，v/v/v）開發(fā)的硅酸涂層板（德國(guó)達(dá)姆施塔特默克公司）上進(jìn)行檢查。碘染色后以及適當(dāng)情況下，紫外線照射后對(duì)平板進(jìn)行檢查，未發(fā)現(xiàn)任何雜質(zhì)。

肽在脂質(zhì)單層中的滲透

使用磁攪拌環(huán)形聚四氟乙烯孔（多孔板，亞相體積1.2 ml，芬蘭赫爾辛基基布隆）測(cè)量肽對(duì)單分子脂質(zhì)膜的滲透。表面壓力（π）通過(guò)連接到連接到奔騰PC的微量天平（Delta-Pi，Kibron）上的Wilhelmy線進(jìn)行監(jiān)測(cè)。將脂質(zhì)在氯仿（~1 mg/ml）中以指定的摩爾比混合，然后在該溶劑中擴(kuò)散到空氣緩沖（5 mM Hepes，0.1 mM EDTA，pH 7.0）界面上。隨后，在向亞相注入馬蓋寧2或吲哚青霉素之前，讓脂質(zhì)單層在不同初始表面壓力（π0）下平衡約15分鐘。肽的最終濃度為1m。注射肽后的增量π在約30min內(nèi)完成，初始表面壓力（π0）與肽滲透到膜中后觀察到的值之間的差值取為?π.所示數(shù)據(jù)表示三次測(cè)量的平均值，表示為?π對(duì)π0。所有測(cè)量均在環(huán)境溫度（~24°C）下進(jìn)行。

LUV的制備

指示的脂質(zhì)在氯仿中混合，然后在氮?dú)饬飨氯コ軇S后在減壓下保持脂質(zhì)殘余至少2小時(shí)。然后在50°C下水合干燥脂質(zhì)，以產(chǎn)生1 mM的脂質(zhì)濃度。使用Lipsofast低壓均質(zhì)器（加拿大渥太華Avestin）通過(guò)兩個(gè)聚碳酸酯過(guò)濾器（孔徑100 nm，微孔，貝德福德，馬薩諸塞州）的堆疊擠出所得分散體，以獲得LUV。

Ie/Im的測(cè)量

芘是準(zhǔn)分子形成有機(jī)熒光團(tuán)的典范，其衍生物在生物分子研究中得到了廣泛的應(yīng)用。單體芘發(fā)射波長(zhǎng)約為398nm的熒光，準(zhǔn)分子（激發(fā)二聚體）通過(guò)發(fā)射波長(zhǎng)約為480nm的熒光松弛回到兩個(gè)基態(tài)芘。穩(wěn)態(tài)Ie/Im值為探針碰撞頻率的質(zhì)量變化提供了一個(gè)相當(dāng)好的度量，反映了芘標(biāo)記脂質(zhì)的橫向擴(kuò)散和局部濃度（簡(jiǎn)要回顧，見(jiàn)Kinnunen等人，1993年；Duportail和Lianos，1996年）。使用Perkin Elmer LS50B熒光光譜儀和磁攪拌恒溫反應(yīng)杯室，使用344 nm的激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)量用PPDPG或PPDPC（X=0.01）標(biāo)記的LUV的熒光發(fā)射光譜。激發(fā)和發(fā)射均使用5nm的帶寬。使用的脂質(zhì)濃度為25 M，溫度保持在25°C。添加適量肽后，在記錄光譜之前，樣品平衡5分鐘。取三次掃描的平均值，分別在~398和480 nm處測(cè)量Im和Ie的發(fā)射強(qiáng)度。所有測(cè)量重復(fù)三次。

DPH的熒光各向異性

DPH以X=0.002加入脂質(zhì)體中。使用的脂質(zhì)濃度為25m，溫度保持在25°C。使用帶有Perkin Elmer LS50B的寶麗來(lái)型濾光片以L格式測(cè)量偏振發(fā)射。使用5αnm帶寬，在360 nm激發(fā)和450 nm發(fā)射下測(cè)量DPH的熒光各向異性r，并使用Perkin Elmer提供的軟件程序計(jì)算其值。所有測(cè)量重復(fù)三次。

巨大脂質(zhì)體的形成

如其他地方所述制備巨型脂質(zhì)體（Angelova和Dimitrov，1986；Holopainen等人，2000）。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將約1–3 l溶解在二乙醚：甲醇（9:1，v/v，最終總脂質(zhì)濃度1 mM）中的所需脂質(zhì)攤鋪在兩個(gè)鉑電極的表面上，隨后在氮?dú)饬飨赂稍铩Ｔ谡婵罩谐榭?小時(shí)，去除可能殘留的有機(jī)溶劑。在蔡司IM-35倒置熒光顯微鏡的工作臺(tái)上放置一個(gè)帶有附加電極和石英窗口底部的玻璃室。在添加1.3 ml pH值為7.4的0.5 mM Hepes緩沖液之前，施加交流磁場(chǎng)（頻率為4 Hz，振幅為0.2 V的正弦波函數(shù)）。在水合作用的第一分鐘內(nèi)，電壓增加到1.0–1.2 V。2–4小時(shí)后關(guān)閉交流電場(chǎng)，并使用Hoffman調(diào)制對(duì)比度（HMC）光學(xué)系統(tǒng)和10/0.25物鏡觀察巨大脂質(zhì)體（調(diào)制光學(xué)系統(tǒng)，紐約州紐約）。巨型脂質(zhì)體的大小通過(guò)微移液管的運(yùn)動(dòng)校準(zhǔn)圖像，作為微操作器（MX831，帶MC2000控制器，SD Instruments，Grants Pass，Oregon）步長(zhǎng)（50 nm）的適當(dāng)倍數(shù)來(lái)測(cè)量。使用帕爾貼冷卻12位數(shù)字CCD攝像機(jī)（C4742-95，日本濱松市濱松）記錄圖像，該攝像機(jī)與計(jì)算機(jī)連接，并由制造商提供的軟件（HiPic 5.0.1）操作。

微量注射技術(shù)

用微處理器控制的水平拉拔器（P-87，Sutter Instrument Co.，加利福尼亞州諾瓦托）用硼硅酸鹽毛細(xì)管（外徑1.2-mm）制成內(nèi)徑>0.5 m的微量移液管（Schnorf et al.，1994）。指示量的肽溶液（10mmHEPES中的0.5mm，0.1mmEDTA，pH 7.0）以氣動(dòng)微注射器（PLI-100，醫(yī)療系統(tǒng)公司，紐約州格林維爾）輸送的一系列單次注射~20FL的形式應(yīng)用于單個(gè)巨大囊泡的外表面。為便于操作，僅使用附著在電極表面的囊泡。所有實(shí)驗(yàn)均在環(huán)境溫度（~24°C）下進(jìn)行，并重復(fù)至少10次。